WiDr人大腸癌細胞

測定方法.

一、細胞凋亡的形態(tài)學檢測

根據(jù)凋亡細胞固有的形態(tài)特征,人們已經(jīng)設計了許多不同的細胞凋亡形態(tài)學檢測方法.

1、光學顯微鏡和倒置顯微鏡

（1） 未染色細胞：凋亡細胞的體積變小、細胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象,細胞凋亡晚期可見凋亡小體.貼壁細胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落.

（2） 染色細胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等.凋亡細胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化,核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài).

2、熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡

 一般以細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學改變?yōu)橹笜藖碓u判細胞凋亡的進展情況.

常用的DNA特異性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342),HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI.三種染料與 DNA的結(jié)合是非嵌入式的,主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū).紫外光激發(fā)時發(fā)射明亮的藍色熒光.

Hoechst是與DNA特異結(jié)合的活性染料,儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度,使用時用PBS稀釋成終濃度為2~5mg/ml.DAPI為半通透性,用于常規(guī)固定細胞的染色.儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度,使用終濃度一般為0.5 ~1mg/ml. 結(jié)果評判：細胞凋亡過程中細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學改變分為三期：Ⅰ期的細胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased）,部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；aⅡ期細胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；bⅡ期的細胞核裂解為碎塊,產(chǎn)生凋亡小體細。

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 細胞處理方法：

一、貼壁細胞
1、 接收到細胞，肉眼觀察細胞培養(yǎng)基顏色，顯微鏡觀察細胞生長情況，并對細胞進行不同倍數(shù)拍照（建議收到時的培養(yǎng)瓶拍一張照片，顯微鏡拍收到時的細胞 100X,200X 各一張）。
2、用 75%的酒精消毒外包裝,在超凈工作臺內(nèi)打開外包裝。
3、嚴格遵循無菌操作規(guī)范，打開細胞培養(yǎng)瓶。
4、37度平衡1-2小時。
5、用移液管吸取培養(yǎng)基，到50ml離心管中，剩下細胞密度達到80%至90%可以傳代，如沒有達到添加6ml新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
6、如果肉眼檢查上清有細胞，對50ml上清進行離心收集細胞，如果細胞連片狀態(tài)，棄掉上清對收集的細胞進行胰酶消化（1ml胰酶37度），接種培養(yǎng)。

二、懸浮細胞
1、接收到細胞，肉眼觀察細胞培養(yǎng)基顏色，顯微鏡觀察細胞生長情況，并對細胞進行不同倍數(shù)拍照（建議收到時的培養(yǎng)瓶拍一張照片，顯微鏡拍收到時的細胞 100X,200X 各一張）。
2、用 75%的酒精消毒外包裝,在超凈工作臺內(nèi)打開外包裝。
3、嚴格遵循無菌操作規(guī)范，打開細胞培養(yǎng)瓶。
4、細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)基用吸管*吸出（嚴禁直接傾倒）。
5、1000rpm，5min 離心，用吸管小心吸出上清，加入培養(yǎng)基，重懸細胞。
6、將重懸好的細胞轉(zhuǎn)入六孔板或者細胞培養(yǎng)瓶種，加入新鮮培養(yǎng)基，置于 37℃，5%CO2 培養(yǎng)（大部分細胞）。